小鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的獲取可通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)，結(jié)合酶消化法與差速貼壁技術(shù)，可獲得高純度細(xì)胞：
 

　　一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
 

　　實(shí)驗(yàn)材料
 

　　試劑：磷酸鹽緩沖液(PBS，無(wú)鈣鎂)、膠原酶(Type II，0.1%-0.2%)、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(如DMEM/F12+20%FBS+1%ECGS+1%青霉素/鏈霉素)、70%乙醇(消毒用)、紅細(xì)胞裂解液(可選)。
 

　　儀器：超凈工作臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱(37℃，5%CO?)、手術(shù)器械(眼科剪、鑷子、顯微鑷)、細(xì)胞篩(100μm和40μm)、離心機(jī)、0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿。
 

　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
 

　　選用健康成年小鼠(如C57BL/6品系)，通過(guò)CO?窒息或頸椎脫臼法處死，并用70%乙醇消毒體表。
 

　　二、主動(dòng)脈分離與清洗
 

　　暴露主動(dòng)脈
 

　　沿腹中線剪開(kāi)胸腔和腹腔，暴露心臟和主動(dòng)脈。
 

　　用鑷子提起心臟，剪斷主動(dòng)脈弓，沿胸主動(dòng)脈向下分離至髂動(dòng)脈分叉處，完整取出主動(dòng)脈。
 

　　去除雜質(zhì)
 

　　將主動(dòng)脈置于預(yù)冷的PBS中，去除周?chē)竞徒Y(jié)締組織。
 

　　縱向剪開(kāi)主動(dòng)脈，用PBS沖洗3次以清除血液和細(xì)胞碎片。
 

　　三、酶消化與細(xì)胞釋放
 

　　膠原酶消化
 

　　將主動(dòng)脈浸泡于0.1%-0.2%膠原酶溶液中，37℃孵育15-30分鐘，期間輕柔振蕩促進(jìn)消化。
 

　　消化完成后，加入含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
 

　　細(xì)胞收集
 

　　用移液槍反復(fù)吹打主動(dòng)脈碎片，釋放內(nèi)皮細(xì)胞。
 

　　過(guò)100μm和40μm細(xì)胞篩去除未消化組織，收集細(xì)胞懸液。
 

　　離心(1000rpm，5分鐘)后棄上清，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
 

　　四、細(xì)胞純化與培養(yǎng)
 

　　差速貼壁法
 

　　將細(xì)胞懸液接種于未包被的培養(yǎng)皿中，37℃靜置1小時(shí)，使成纖維細(xì)胞優(yōu)先貼壁。
 

　　收集未貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿中，提高貼壁率。
 

　　磁珠分選(可選)
 

　　使用CD31或CD144抗體標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)磁珠分選進(jìn)一步提高純度。
 

　　細(xì)胞培養(yǎng)
 

　　將純化后的細(xì)胞接種于包被的培養(yǎng)皿中，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。
 

　　置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液一次。
 

　　觀察細(xì)胞形態(tài)，呈“鵝卵石樣”鋪路石狀時(shí)表明細(xì)胞狀態(tài)良好。
 

　　細(xì)胞傳代
 

　　當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，按1:2或1:3比例接種。
 

　　原代內(nèi)皮細(xì)胞傳代次數(shù)建議不超過(guò)5代，以防表型丟失。
 

　　五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
 

　　無(wú)菌操作：所有步驟需在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，避免污染。
 

　　消化時(shí)間控制：膠原酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，需優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
 

　　細(xì)胞鑒定：通過(guò)免疫熒光檢測(cè)CD31、vWF或eNOS等內(nèi)皮標(biāo)志物確認(rèn)細(xì)胞純度(純度應(yīng)高于90%)。
 

　　避免過(guò)度傳代：原代內(nèi)皮細(xì)胞傳代次數(shù)有限，過(guò)度傳代可能導(dǎo)致功能喪失。